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    Random priming

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    DNA聚合酶要進行DNA聚合反應時一定要有引子 (primer),因為它只能以引子所提供的3’-OH為起始點進行延伸 (extension) 的工作,而不能就地重新合成新的DNA (de novo synthesis)。 一般實驗常以人工合成的寡核苷酸為引子進行DNA聚合反應,這時固然可以根據已知序列設計核酸引子,但也可以采用逢機引子(random primers)。 所謂逢機引子即其序列為逢機序列,不經特別設計,目前應用最廣者是以自動化機器所合成的、六到八個核苷酸長的寡核苷酸混合物;反應進行中若有任何一條逢機引子結合到模版DNA,即可引導DNA聚合反應的進行。 以random priming方法進行核酸標定,是以逢機引子引導Klenow fragment(large fragment of E. coli DNA polymerase I) 進行DNA聚合反應,并在反應過程中添加 [α-32P]dNTP或DIG-11-dUTP等標定物質。 而為了避免random priming也發生于載體部份的DNA,最好不要直接以質體DNA為模版進行標定反應,而應預先將目標DNA自載體切除出來。

     
    儀器用具:微量離心機;沸水浴及冰浴
     
    藥品試劑:
    模版DNA (pBlueGus 的BamHI-HindIII DNA 片段,將由助教提供)
    0.2 M EDTA, pH 8.0
    4 M LiCl
    Random priming kit (Roche):
    Hexanucleotide mix (random primer)
    dNTP mixture (1 mM dATP, 1 mM dCTP, 1 mM dGTP, 0.65 mM dTTP, 0.35
    mM DIG-11-dUTP, pH 7.5)
    Klenow enzyme (2 U/μL)
    絕對酒精
    70%酒精
    TE (10 mM Tris-Cl, pH 8.0; 1 mM EDTA)
     
    方法步驟:
    ◆ 以下反應條件與步驟主要參照random priming kit 制造廠商所提供的產品說明書。
    1) 取100 ng 模版DNA,加入適量去離子水,把體積補足為15 μL。
    2) 于沸水中加熱10 min。
    ◆ 請記得以夾子固定微量離心管的管蓋部份,以免離心管在加熱過程中蓋子爆開、進水!
    3) 加熱后,迅速把微量離心管移至冰浴中,靜置數分鐘。
    4) 離心數秒后,依序加入下列三種試劑:
    2 μL hexanucleotide mix
    2 μL dNTP mixture
    1 μL Klenow enzyme
    5) 以指頭輕彈離心管,以便混合均勻。
    6) 短暫離心后,置于37℃恒溫水槽中作用2 h。
    ◆ 反應時間至少須要1 h,最長可反應過夜。
    7) 作用完畢的后,加入2 μL 的0.2 M EDTA,以便終止DNA 聚合反應。
    8) 加入2.5 μL 4 M LiCl及75 μL純酒精,混合均勻,置 -20℃過夜。
    隔天:
    1) 于13,000 rpm,4℃離心15 min。
    2) 倒出上清液,加入50 μL 的70%酒精,再離心5 min。
    3) 倒出上清液并風干DNA。
    4) 最后以50 μL TE 溶解DNA。

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